MỤC LỤC BÀI VIẾT
16S rRNA Next-Generation Sequencing (16SNGS): Tương lai cho chẩn đoán vi sinh vật
Trong lĩnh vực y học, việc định danh chính xác vi khuẩn gây bệnh là yếu tố then chốt cho việc điều trị hiệu quả và kiểm soát lây nhiễm. Trong nhiều thập kỷ, nuôi cấy và xét nghiệm sinh hóa (CBtest) là “tiêu chuẩn vàng” trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán vi sinh vật. Tuy nhiên, với sự tiến bộ của công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS), giải trình tự 16S rRNA (16SNGS) đang nổi lên như là một phương pháp tiềm năng để thay thế. Mặc dù 16SNGS mang lại nhiều lợi ích vượt trội, việc chuyển đổi sang công nghệ này đặt ra không ít thách thức. Bài viết này sẽ phân tích chi tiết những ưu điểm và hạn chế của 16SNGS, đồng thời thảo luận về tiềm năng của nó trong bối cảnh các phòng thí nghiệm chẩn đoán vi sinh vật trong hiện tại và tương lai.
CBtest: Tiêu chuẩn vàng truyền thống với những giới hạn
CBtest là phương pháp truyền thống xác định vi khuẩn dựa trên đặc điểm kiểu hình như hình thái, sự tăng trưởng khuẩn lạc và đặc tính chất trao đổi chất. Quy trình bao gồm nhuộm Gram, nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu và thực hiện các xét nghiệm sinh hóa. Phương pháp này phổ biến và đã được chuẩn hóa rộng rãi, là nền tảng của nhiều phòng thí nghiệm ở khắp nơi trên thế giới.
Tuy nhiên, CBtest có nhiều hạn chế đáng kể. Không phải tất cả vi khuẩn đều có thể được nuôi cấy thành công, có thể kể đến như vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt, vi khuẩn sống sót nhưng không thể nuôi cấy, hoặc các vi khuẩn yêu cầu môi trường sinh sống đặc biệt. Các mầm bệnh hiếm gặp ở vi khuẩn có thể bị bỏ sót nếu không có các xét nghiệm đặc hiệu sẵn có. Hơn nữa, kết quả dễ bị sai lệch trong các trường hợp nhiễm đa vi khuẩn hay sự thay đổi kiểu hình do môi trường. Quan trọng nhất, CBtest tốn thời gian, đặc biệt đối với vi khuẩn phát triển chậm, có thể dẫn đến việc điều trị chậm trễ, sử dụng kháng sinh phổ rộng không cần thiết và tăng nguy cơ lây nhiễm. Điều này ngày càng trở thành vấn đề nghiêm trọng ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình, nơi các chiến lược kiểm soát lây nhiễm có thể chưa được ưu tiên.
16SNGS: Bước tiến của giải trình tự gene
16SNGS xác định vi khuẩn thông qua trình tự nucleotide của đoạn gene 16S rRNA. Gene này được bảo tồn, đặc hiệu cho chi vi khuẩn (96%) và thậm chí cả loài (87.5%) trong một số trường hợp. Ưu điểm của 16SNGS là phương pháp này không cần nuôi cấy vi khuẩn, chỉ yêu cầu DNA của chúng. Điều này đặc biệt hữu ích khi kết quả CBtest không rõ ràng hoặc khi xử lý các mẫu đa vi khuẩn (polymicrobial samples).
Quy trình 16SNGS bao gồm các bước chính là: Chiết xuất DNA từ mẫu bệnh phẩm – Chuẩn bị thư viện gen (khuếch đại các vùng biến đổi của gen 16S rRNA, thường là V4-V6) – Giải trình tự. Để đối phó với số lượng mẫu lớn, các hệ thống chiết xuất DNA và chuẩn bị thư viện tự động đang ngày càng trở nên thiết yếu. Sau giải trình tự, dữ liệu thô được xử lý (lọc chất lượng thấp, loại bỏ chimera, adapters,…) và phân tích tin sinh học để định danh vi khuẩn bằng cách đối chiếu với các cơ sở dữ liệu tham chiếu công khai như NCBI, RDP, SILVA, và EzBioCloud.
Ưu điểm vượt trội của 16SNGS
Bất chấp những thách thức trong việc triển khai, 16SNGS mang lại nhiều lợi thế đáng kể so với CBtest:
- Định danh vi khuẩn không thể nuôi cấy hoặc khó nuôi cấy: Đây là ưu điểm nổi bật nhất. Nhiều vi khuẩn gây bệnh không thể phát triển trong môi trường nuôi cấy thông thường (ước tính chỉ khoảng 2% vi khuẩn môi trường và 20% hệ vi sinh vật đường ruột có thể nuôi cấy được) đã được định danh bằng 16SNGS.
- Thời gian quay vòng (TAT) ngắn và dễ dự đoán: CBtest thường mất 3-5 ngày và rất phụ thuộc vào việc thu được chủng nuôi cấy thuần khiết cũng như tuân thủ các quy trình nghiêm ngặt, dẫn đến TAT kéo dài cho các mầm bệnh khó hoặc chậm phát triển. Ngược lại, 16SNGS có quy trình chuẩn hóa hơn sau bước chiết xuất DNA, cho phép TAT nhất quán và dự đoán được (ví dụ, một nghiên cứu cho thấy TAT là 5 ngày, bất kể vi khuẩn gây nhiễm).
- Độ chính xác cao: Việc xác định vi khuẩn bằng 16SNGS dựa trên danh tính trình tự gen, mang lại độ đặc hiệu cao ở cấp độ chi và loài. Điều này khắc phục nhược điểm của CBtest, nơi kết quả có thể chủ quan, phụ thuộc vào người vận hành. Do đó, 16SNGS với các quy trình kiểm soát chất lượng chặt chẽ và các quy trình tin sinh học được xác nhận trong tương lai sẽ đảm bảo độ chính xác chẩn đoán vượt trội.
- Tính di động dữ liệu và sẵn sàng chuyển đổi công nghệ: Kết quả 16SNGS có thể dễ dàng chia sẻ giữa các phòng thí nghiệm, là nguồn tài nguyên quý giá cho giám sát mầm bệnh và nghiên cứu dịch tễ học. Điều này phù hợp với xu hướng số hóa, giúp các phòng thí nghiệm có khả năng sẵn sàng cao hơn cho việc chuyển đổi sang phân tích bộ gen toàn diện trong tương lai
Thách thức cần phải đối mặt
Mặc dù có nhiều ưu điểm, việc triển khai 16SNGS tại các quốc gia như Malaysia vẫn đối mặt với những rào cản đáng kể:
- Chi phí cao: Việc chuyển đổi đòi hỏi nguồn vốn lớn để mua sắm thiết bị NGS đắt tiền, thuốc thử và chi phí bảo trì định kỳ. Điều này dẫn đến chi phí chẩn đoán tăng cao, có thể trở thành gánh nặng tài chính cho bệnh nhân.
- Thiếu cơ sở hạ tầng và chuyên môn kỹ thuật: 16SNGS yêu cầu cơ sở hạ tầng chuyên biệt và đội ngũ kỹ thuật viên có chuyên môn về sinh học phân tử và tin sinh học. Nhiều chuyên gia vi sinh và kỹ thuật viên hiện nay có thể chưa được đào tạo về các phương pháp thực nghiệm và sử dụng các công cụ tin sinh học phức tạp.
- Thiếu mẫu vi khuẩn để kiểm tra lại và xét nghiệm độ nhạy kháng sinh (AST): Vì 16SNGS sử dụng DNA và không cần nuôi cấy, sẽ không có mẫu vi khuẩn sống để kiểm tra lại hoặc thực hiện AST. Điều này đòi hỏi các phòng thí nghiệm phải tìm giải pháp thay thế cho AST.
- Độ phân giải phân loại thấp trong một số trường hợp: Do 16SNGS thường chỉ giải trình tự các vùng biến đổi ngắn của gen 16S rRNA, có thể không đủ để phân biệt chính xác một số loài vi khuẩn, đặc biệt khi chúng có độ tương đồng cao.
- Nguy cơ nhiễm DNA: Ô nhiễm DNA có thể xảy ra ở bất kỳ bước nào, từ mẫu bệnh phẩm đến thuốc thử, dẫn đến chẩn đoán sai. Dù các hệ thống tự động có thể giảm thiểu rủi ro, chúng cũng làm tăng chi phí thử nghiệm.
- Thiếu chuẩn hóa và xác nhận quy trình: Việc sử dụng 16SNGS cho chẩn đoán vẫn đang trong quá trình phát triển và đòi hỏi các giao thức được chuẩn hóa, xác nhận nghiêm ngặt về cả phòng thí nghiệm, thuật toán phân tích và cơ sở dữ liệu tham chiếu.
Hướng đi tương lai
Để vượt qua những thách thức này và khai thác tiềm năng của 16SNGS, một số chiến lược có thể cân nhắc như sau:
- Đầu tư vào máy giải trình tự thế hệ mới : Điều này không chỉ phục vụ 16SNGS mà còn cho phép các nghiên cứu bộ gene toàn diện trong tương lai.
- Thiết lập các phòng thí nghiệm 16SNGS tập trung tại các bệnh viện lớn (cấp 3 trở lên): Các trung tâm này có thể cung cấp dịch vụ cho các bệnh viện nhỏ hơn, đặc biệt đối với các trường hợp vi khuẩn khó nuôi cấy.
- Sử dụng các quy trình tin sinh học có sẵn: Các ứng dụng thương mại hay các chương trình có sẵn trên web giúp đơn giản hóa phân tích dữ liệu, giảm yêu cầu về chuyên môn tin sinh học.
- Tích hợp các nền tảng xét nghiệm độ nhạy kháng sinh nhanh (rapid AST): Để cung cấp thông tin AST kịp thời cho việc kê đơn kháng sinh.
Kết luận
Với sự phát triển của NGS và xu hướng chuyển đổi sang các công nghệ dựa trên nucleotide, 16SNGS đang được đề xuất là một nền tảng đầy hứa hẹn cho việc xác định vi khuẩn trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán vi sinh vật. Mặc dù đối mặt với các thách thức về chuyên môn kỹ thuật, tài chính và xác nhận, những rào cản này có thể được khắc phục nhờ sự giảm giá liên tục và sự sẵn có của các giải pháp tin sinh học thương mại. Với những ưu điểm về độ chính xác chẩn đoán và quy trình hợp lý hóa, 16SNGS được kỳ vọng sẽ đóng một vai trò quan trọng và lâu dài trong việc xác định vi khuẩn.
LOBI Vietnam là công ty tiên phong trong lĩnh vực Đọc trình tự gen thế hệ mới NGS (Next Generation Sequencing) và Phân tích Tin sinh học. Liên hệ hotline/Zalo 092.510.8899 để biết thêm chi tiết.
