Phương pháp hóa học giải trình tự DNA

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa họcđể có thể giải trình tự một đoạn DNA. Nguyên tắc của phương pháp này là:

  1. Trướchết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P);
  2. Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chấthóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạnDNA. Ví dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng các thêm một gốc methyl ở vịtrí nitrogen thứ 7 (N7), hydrazine làm biến đổi Thymine và Cytosine, hydrazine vàNaCl để làm biến đổi Cytosine, acid để làm biến đổi Guanine và Adenine, NaOH đểlàm biến đổi Adenine và Cytosine với Adenine ưu tiên hơn Cytosine. Như vậy tronggiai đoạn này, phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm, DNA được xửlý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa học nêu trên để mỗi ốngnghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn DNA này chỉ có một vị trínucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi;
  3. Các nucleotide bị biến đổi nàysẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đường-phosphate (sugar-phosphate backbone) của đoạn DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầubị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy ra khỏi mạch khung (hình 1).
  4. Thực hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gelpolyacrylamide biến tính để các mạch đơn trong mẫu di chuyển trong gel không bị biếnđổi trong quá trình điện di. Nhờ đó, sau khi hoàn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừngtại các vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọcsuốt chiều dài của gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều bị đánh dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P.Từ các vạch trên phim xạ ký tự ghi này (autoradiography), có thể đọc được trình tự củacác nucleotide của đoạn DNA (hình 2).

Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert trên thực tế không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm,trong đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các chất hóa học saocho khi xử lý mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đầu đánh dấu 32P được tách ra. Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam Gilbert hiện nay ít được sử dụng, màthay vào đó các nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội hơn.

phuong phap hoa hoc giai trinh tu dna h1

Hình 1: Các mạch đơn có một đầu đánh dấu với 32P và một đầu base Guanine bị lấy khỏi mạch khung do bị biến đổi. Các mạch đơn này có chiều dài ngắn khác nhau tùy thuộc vào vị trí của Guanidine trên đoạn DNA.

phuong phap hoa hoc giai trinh tu dna h2

Hình 2: Hình xạ ký tự ghi trên phim nhạy tia X một gel polyacrylamide sau khi đã điện di. Các vạch là vị trí các mạch đơn bị dừng lại sau điện di. Các vị trí này gần hay xa khởi điểm là tuỳ kích thước của mạch đơn dài hay ngắn khác nhau. Từ các vạch này, đọc trình tự của đoạn DNA trong mẫu.

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai.