Phương pháp enzyme giải trình tự DNA

Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977, và ngày hôm nay phương pháp này càng ngày càng được hoàn thiện và thực hiện dễ dàng tại các phòng thí nghiệm.

Nguyên tắc chung của phương pháp này có thể tóm tắt như sau:

Hình 1: Phương pháp Enzyme giải trình tự DNA. Đoạn DNA được chèn vào một vector tại một vị trí biết rõ trình tận. Trong tự, nhờ hình đó các có thể nucleotide tổng hợp đánh được dấu các * là mạch các nucleotide đơn có một được đầu là dánh mồi, dấu một ³⁵S, đầu nhờ là các vậy nucleotide các mạch đơn được đánh dấu.

Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ. Chuyển thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.

Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng rất giới hạn các nucleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP, có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, C và G). Phản ứng được thực hiện trong 4 ống, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, men DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc (hình 1).

Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính. Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA (hình 2).

Hình 2: Hình xạ ký tự ghi một kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide. Từ kết quả này, đọc được trình tự DNA