Tổng quan và Đặt vấn đề

• Phân tích trình tự gen 16S rRNA (phân tích 16S) được sử dụng rộng rãi để phân tích hệ vi sinh vật bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS). Tuy nhiên, vẫn chưa có một phương pháp chuẩn vàng nào được thiết lập, và việc lựa chọn vùng biến đổi của gen 16S rRNA để nhắm mục tiêu là một vấn đề gây tranh cãi. Các vùng V1–V2 (V12) và V3–V4 (V34) là hai vùng được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về hệ vi sinh vật đường ruột. Một số nghiên cứu trước đây đã đưa ra các kết luận khác nhau về việc vùng nào phù hợp hơn. Chẳng hạn, một nghiên cứu cho rằng V34 phù hợp hơn V12 vì khả năng phát hiện Bifidobacteriales cao hơn. Tuy nhiên, đã có một phiên bản mồi xuôi V1 mới (27Fmod) được phát triển để cải thiện đáng kể khả năng phát hiện Bifidobacterium so với mồi cũ.
• Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá và so sánh dữ liệu phân tích 16S từ mẫu phân của 192 người tình nguyện khỏe mạnh Nhật Bản sử dụng bộ mồi V12 được chỉnh sửa (sử dụng 27Fmod) và bộ mồi V34 tiêu chuẩn. Ngoài ra, nghiên cứu cũng so sánh kết quả giữa hai phiên bản của công cụ phân tích bioinformatics QIIME (QIIME1 và QIIME2). Mục tiêu là để tối ưu hóa quy trình phân tích hệ vi sinh vật đường ruột, đặc biệt là đối với quần thể người Nhật Bản.

Mô hình

• QIIME1 (v1.8.0): Đọc ghép nối được gom nhóm theo độ tương đồng 97% thành các Đơn vị phân loại vận hành (OTU). Thông tin phân loại được gán sử dụng cơ sở dữ liệu Greengenes (v13.8) và trình phân loại RDP.
• QIIME2 (v2020.2): Sử dụng DADA2 để ghép nối đọc, lọc và khử nhiễu, tạo ra các Biến thể trình tự Amplicons (ASV). Thông tin phân loại được gán sử dụng trình phân loại naive Bayes trong QIIME2 với dữ liệu vùng V2 (cho V12) và V34 (cho V34) từ Greengenes.

• Đa dạng Alpha: Được đánh giá ở độ sâu 30,000 đọc sử dụng bảng OTU/ASV.
• Đa dạng Beta: Sự khác biệt giữa các cộng đồng V12 và V34 được tính bằng độ phân ly Bray-Curtis và đánh giá bằng phép phân tích phương sai đa biến hoán vị (PERMANOVA).
• Thành phần vi khuẩn: So sánh thành phần tương đối ở cấp độ ngành và chi giữa V12 và V34.
• PCR định lượng thời gian thực (qPCR): Được thực hiện để ước tính độ phong phú thực tế của các chi Akkermansia, Bifidobacterium, Bacteroides và Faecalibacterium. Primer được sử dụng nhắm vào gen rplL (đối với Akkermansia trong phân tích mock community ban đầu, nhưng trong qPCR cho mẫu phân người thì nhắm vào 16S rRNA) và các gen 16S rRNA khác. Dữ liệu được chuẩn hóa bằng cách trừ giá trị ngưỡng chu kỳ (Ct) của 16S rRNA tổng từ giá trị Ct của vi khuẩn mục tiêu.

Ứng dụng

Bài báo tập trung vào việc đánh giá và chuẩn hóa phương pháp phân tích 16S rRNA để có thể đánh giá chính xác thành phần vi khuẩn đường ruột. Kết quả của nghiên cứu này có ứng dụng trực tiếp trong việc lựa chọn bộ mồi và quy trình phân tích bioinformatics phù hợp hơn cho các nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột ở người Nhật Bản. Bằng cách so sánh dữ liệu từ V12 (với mồi 27Fmod đã được cải tiến) và V34 với dữ liệu qPCR được xem là gần với độ phong phú thực tế, nghiên cứu cung cấp bằng chứng để khuyến nghị bộ mồi hiệu quả hơn. Cụ thể, việc xác định rằng V12 (27Fmod) cho kết quả phát hiện Akkermansia gần hơn với qPCR và V34 ước tính quá cao chi này có ý nghĩa quan trọng cho các nghiên cứu liên quan đến Akkermansia như chỉ số sức khỏe. Tương tự, mặc dù cả V12 và V34 đều ước tính hơi thấp Bifidobacterium so với qPCR, nghiên cứu này xác nhận mồi 27Fmod cải thiện đáng kể khả năng phát hiện Bifidobacterium so với các mồi V12 trước đây.

Thảo luận và Hạn chế

• Sự đa dạng beta giữa các cộng đồng V12 và V34 được xác định là khác biệt đáng kể về mặt thống kê, mặc dù mức độ khác biệt là nhỏ. Ở cấp độ ngành, Actinobacteria và Verrucomicrobia được phát hiện ở mức cao hơn với V34 so với V12. Đặc biệt, ở cấp độ chi, Bifidobacterium (thuộc Actinobacteria) và Akkermansia (thuộc Verrucomicrobia) có thành phần tương đối cao hơn với V34.
• Khi so sánh với kết quả qPCR, độ phong phú của Akkermansia được phát hiện bằng qPCR gần với dữ liệu V12, nhưng lại thấp hơn đáng kể so với dữ liệu V34. Điều này chỉ ra rằng phân tích 16S sử dụng bộ mồi V34 có xu hướng ước tính quá cao Akkermansia. Một khả năng giải thích cho sự khác biệt này là sự tương đồng cao ở vùng V34 giữa Akkermansia và một số vi khuẩn khác (ví dụ: Cronobacter), nhưng lại có sự khác biệt lớn ở vùng V12. Trình tự V34 của Cronobacter cho thấy độ tương đồng 99.32% với Akkermansia, trong khi V12 tương ứng chỉ là 71.43%. Đối với Bifidobacterium, qPCR phát hiện độ phong phú cao hơn cả dữ liệu V12 và V34. Cả hai bộ mồi 16S đều dường như ước tính hơi thấp chi này so với qPCR. Tuy nhiên, mồi V12 27Fmod đã cải thiện đáng kể khả năng phát hiện Bifidobacterium (trung bình 2.1%) so với các mồi V12 tiêu chuẩn trước đây (0.03%), mặc dù V34 vẫn cho thành phần tương đối trung bình cao hơn (3.3%). Đối với Bacteroides và Faecalibacterium (đối chứng), kết quả 16S (V12 và V34) và qPCR cho thấy xu hướng tương tự.

Kết luận

LOBI Vietnam là công ty tiên phong trong lĩnh vực Đọc trình tự gen thế hệ mới NGS (Next Generation Sequencing) và Phân tích Tin sinh học. Liên hệ hotline/Zalo 092.510.8899 để biết thêm chi tiết.