Metagenomics

Nghiên cứu Metagenomics có thể thu nhận và xác định các enzym mới có ứng dụng công nghiệp từ những môi trường khắc nghiệt nơi mà những vi sinh vật không thể phân lập được sinh sống. Trong những nghiên cứu như vậy, metagenomics chức năng (functional metagenomics) cho phép phân lập các gen mã hóa các gen cực trị (extremozymes), các enzym có khả năng hoạt động xúc tác trong điều kiện khắc nghiệt, hoặc các gen sẽ cho phép hiểu rõ hơn về các cơ chế làm cho các sinh vật đó chống chịu với các điều kiện môi trường khắc nghiệt.

Shotgun Sequencing

Amplicon Sequencing

Đọc trình tự toàn bộ DNA Không bị thiên lệch bởi primer amplicon Cung cấp đầy đủ thông tin về chức năng của hệ gen vi sinh vật Dữ liệu lớn, Nhiều thông tin Độ phức tạp cao, dẫn đến yêu cầu về năng lực máy chủ cao Chi phí cao Có nguy cơ bị nhiễm DNA từ môi trường và vật chủ

Đọc trình tự vùng gene cụ thể (16S/18S rRNA gene) Không bị nhiễm DNA từ vật chủ hay nấm, thực vật của môi trường  gene bảo thủ cao nên dễ dàng nhắm đích toàn bộ vi sinh vật dễ dàng phân biệt giữa các chi (genus) với các variable regions Dữ liệu nhỏ, không có thông tin về chức năng Độ phức tạp thấp, dễ phân tích Chi phí thấp Bất lợi: các vùng siêu biến variable regions) có thể gây ra thiên lệch bởi việc lựa chọn primer Do dựa trên các gene bảo thủ đã biết khiến cho việc phân giải các loài và các chủng gặp khó khăn

Quy trình phân tích

Quy trình phân tích được chia làm 2 nhánh tương ứng với 2 hướng tiếp cận: Amplicon và Shotgun. Workflow của từng quy trình như hình bên dưới.

Tiền xử lý dữ liệu đọc trình tự

Có rất nhiều cách để lọc và cắt bỏ trình tự chưa tốt đối với dữ liệu NGS. Và bạn luôn phải thử đúng sai và chấp nhận đánh đổi giữa chất lượng và thông tin. Để đạt được chất lượng cao, bạn cần lọc bỏ nhiều trình tự hơn, đồng nghĩa là bạn cũng mất đi nhiều thông tin hơn.

Lưu ý rằng, loại bỏ các Chimera reads là cần thiết do trong quá trình PCR, các trình tự có thể gộp lại tạo ra trình tự lai.

Phân cụm OTU

Từ dữ liệu sau tinh sạch, nhiệm vụ của chuyên viên phân tích tin sinh học sau đó là xác định các loài và kiểm đếm sự xuất hiện của các loài. Do bản chất không đầy đủ của phân loại vi khuẩn và sự hiện diện của các lỗi trình tự trong các lần đọc NGS, một cách tiếp cận phổ biến là phân cụm các trình tự read có một mức độ tương đồng nào đó thành các chuỗi đại diện của loài giả được gọi là Đơn vị phân loại hoạt động (Operational Taxonomic Units – OTU). Các trình tự có mức độ tương đồng cao (ví dụ là > 97%) được nhóm lại với nhau và được đại diện bởi một chuỗi OTU duy nhất. Đầu ra chính của quy trình phân nhóm và kiểm đếm là một bảng OTU, liệt kê sự phong phú của các OTU trong các mẫu đang điều tra. Các phân tích thứ cấp bao gồm các ước tính về sự đa dạng alpha và beta trong bối cảnh siêu dữ liệu mẫu, ngoài các thử nghiệm thống kê về mức độ phong phú khác biệt.

Tìm kiếm tương đồng trong cơ sở dữ liệu marker, taxonomy và chức năng

Để xác định loài, các trình tự sẽ được tìm kiếm tương đồng trong các cơ sở dữ liệu tham chiếu cho Amplicon (green genes và silva) và shotgun (MetaPhlAn2) . Mức độ chính xác của kết quả phụ thuộc hoàn toàn vào mức độ đầy đủ của các CSDL. Thế nhưng, một điều chắc chắn rằng các cơ sở dữ liệu chỉ ngày càng hoàn thiện mà không bao giờ đạt mức đầy đủ.

Đối với các phân tích chức năng, chúng ta có thể sử dụng các cơ sở dữ liệu sau:

• Databases to identify gene families
  • UniRef50
  • UniRef90
• Grouping in other functional categories
  • MetaCyc Reactions
  • KEGG Orthogroups (KOs)
  • Pfam domains
  • Level-4 enzyme commission (EC) categories
  • EggNOG (including COGs)
  • Gene Ontology (GO)
  • Informative GO
• Pathway reconstruction

Kết quả phân tích

Bảng OTU

Biểu đồ tương tác Krona

Phinch